Laporan Praktikum Kultur HUVECs

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kultur sel (bahasa Inggris: cell culture) ialah suatu proses dimana suatu sel dari suatu jaringan diambil dan ditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol dan aseptik. Sel yang digunakan untuk dikultur biasanya diambil dari jaringan eukaryota. Sel tersebut akan tumbuh dan bertambah banyak dalam kondisi in vitro. Kultur sel (bahasa Inggris: cell line) juga dapat berarti suatu koloni sel yang telah mapan, sehingga mampu melakukan proliferasi tanpa batas waktu (Wikipedia, 2009). Koloni sel tersebut dapat bermutasi menjadi koloni dengan kultur berbeda, atau merupakan sub-kultur hasil mutasi dari kultur sel sebelumnya (Wikipedia, 2011). Sel endotel pembuluh darah merupakan satu lapis sel yang terletak diantara aliran darah dan jaringan. Selain sebagai barier terhadap difusi makromolekul ke jaringan, sel endotel pembuluh darah juga mempunyai fungsi lain, seperti pengaturan tonus otot polos pembuluh darah, haemostasis dan koagulasi, pertahanan tubuh dan angiogenesis. Dengan adanya disfungsi endotel akibat beberapa kondisi seperti diabetes, dan penyakit jantung akan berdampak pada timbulnya penyulit penyakit tersebut, seperti mikro angiopati, iskemia, gagal ginjal dan sebagainya (Nurhidayat, 2010). Dalam mempelajari peran sel endotel (struktur dan fungsi) pada patomekanisme penyakit atau mengembangkan obat yang bertarget pada sel endotel, dapat digunakan penelitian in vivo menggunakan hewan coba atau manusia dan atau in vitro menggunakan kultur sel. Ada dua sumber sel yang dapat dipergunakan dalam pembuatan kultur sel endotel yaitu sel binatang dan sel manusia. Pemilihan sumber sel endotel tergantung pada tujuan penelitian dan ketersediaan sel. Untuk kultur sel endotel pembuluh darah yang berasal dari sel manusia yang lazim digunakan berasal dari vena umbilikal (Nurhidayat, 2010). Pesatnya kemajuan ilmu Biologi Molekuler memberikan kontribusi terhadap perkembangan ilmu Kebidanan molekuler, khususnya dalam bidang patobiologi molekuler yang mencakup pemahaman sign dan symptom secara lebih mendasar. Pemahaman gangguan haemostasis pada tataran molekuler yang belum memunculkan sign dan symptom sebagai manifestasi klinik, akan menghasilkan diagnosis molekuler yang bersifat lebih akurat dan dini. Keberhasilan dalam mengungkap patobiologi molekuler suatu penyakit merupakan titik cerah penanganan paripurna penyakit tersebut, mulai dari pencegahan, diagnosis, dan terapi berdasarkan ”molecular target” nya, sehingga dapat mengurangi morbiditas dan efek samping pada saat intervensi medik (FK UNS, 2013). Dalam laporan praktikum ini akan dibahas mengenai “Pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs)” yang akan menambah wawasan kita mengenai pentingnya pemeriksaan ini bagi tenaga kesehatan khususnya bidan dalam mengidentifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu sel tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis suatu penyakit tertentu pada pasien. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang masalah sebagaimana terurai dimuka, maka dapat dirumuskan masalah : “Bagaimana pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs)?” 1.3 Tujuan 1.3.1 Tujuan Umum Untuk mengenalkan dan mengetahui konsep dasar, kegunaan, prinsip, metode, bahan isolasi sel endotel, media kultur, alat (instrumen), pengukuran Ca2+ sitosol (Fura 2-AM), cara pembuatan larutan, prosedur kerja dan hasil serta meningkatkan kemampuan dalam teknik pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2 Tujuan Khusus 1.3.2.1 Untuk mengetahui konsep dasar pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.2 Untuk mengetahui kegunaan pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.3 Untuk mengetahui prinsip pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.4 Untuk mengetahui metode dalam pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.5 Untuk mengetahui bahan isolasi dalam pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.6 Untuk mengetahui media kultur dalam pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.7 Untuk mengetahui alat (instrument) dalam pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.8 Untuk mengetahui cara pengukuran Ca2+ sitosol (Fura 2-AM) dalam pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.9 Untuk mengetahui cara pembuatan larutan dalam pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.10 Untuk mengetahui prosedur kerja isolasi dan pembuatan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.3.2.11 Untuk mengetahui hasil pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) 1.4 Manfaat 1.4.1 Manfaat Teoritis Dapat memperkaya konsep atau teori yang menyokong perkembangan ilmu pengetahuan kebidanan khususnya yang terkait dengan pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs). 1.4.2 Manfaat Praktisi Dasar Praktik laboratorium dari pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) yang telah diperoleh di perkuliahan dapat digunakan sebagai dasar pemeriksaan penunjang bagi profesi kebidanan dalam memberikan pelayanan kebidanan kepada ibu dan bayi, keluarga maupun masyarakat demi meningkatkan kesehatan ibu dan anak, keluarga dan masyarakat.  BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN HASIL PENELITIAN 2.1 Konsep Dasar Menurut Suryowinoto (1991) dalam Muhammad (2012), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tertentu yang mempunyai sifat seperti induknya. Kultur jaringan (Tissue Culture) merupakan salah satu cara perbanyakan jaringan secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan jaringan dengan cara mengisolasi bagian jaringan, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian jaringan dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi jaringan lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan jaringan dengan menggunakan bagian vegetatif jaringan menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Pengertian kultur sel adalah sel yang dapat hidup secara in vitro dan masih mempunyai sifat-sifat mirip dengan sel intak/sel asalnya, Lepas dari pengaruh sistemik, sel-sel tertentu mengadakan proliferasi tetapi masih dalam keadaan tidak terdiferensiasi. Kultur sel bukan suatu teknik baru. Merupakan metode untuk mempelajari perubahan fungsi sel/jaringan tanpa pengaruh sistemik. Mula-mula merupakan fragmen jaringan yang diletakkan di cawan kultur. kultur sel dimulai dengan menanam sel-sel embrionik. Kultur sel dapat dipakai untuk bermacam penelitian, misalnya antara lain antivitas intraseluler, intraseluler flux, ekologi sel, interaksi antar sel (Noor, 2013). Sel merupakan unit struktural fungsional terkecil dari kehidupan. Sel dibentuk atas berbagai kompartemen. Organ tubuh manusia terbentuk dari sel dan matriks interselular. Untuk mengamati sel dan jaringan tubuh yang berukuran kecil diperlukan mikroskop dan pengetahuan pemrosesan jaringan dan istilah-istilah dalam pengamatan mikroskopis sel (Zulham, 2011). Gambar 2.1 Struktur Matriks Ekstraseluler (Frisca, 2009) Sel endotel pembuluh darah merupakan satu lapis sel yang terletak diantara aliran darah dan jaringan. Selain sebagai barier terhadap difusi makromolekul ke jaringan, sel endotel pembuluh darah juga mempunyai fungsi lain, seperti pengaturan tonus otot polos pembuluh darah, haemostasis dan koagulasi, pertahanan tubuh dan angiogenesis. Dengan adanya disfungsi endotel akibat beberapa kondisi seperti diabetes, dan penyakit jantung akan berdampak pada timbulnya penyulit penyakit tersebut, seperti mikro angiopati, iskemia, gagal ginjal dan sebagainya (Nurhidayat, 2010). Dalam mempelajari peran sel endotel (struktur dan fungsi) pada patomekanisme penyakit atau mengembangkan obat yang bertarget pada sel endotel, dapat digunakan penelitian in vivo menggunakan hewan coba atau manusia dan atau in vitro menggunakan kultur sel. Ada dua sumber sel yang dapat dipergunakan dalam pembuatan kultur sel endotel yaitu sel binatang dan sel manusia. Pemilihan sumber sel endotel tergantung pada tujuan penelitian dan ketersediaan sel. Untuk kultur sel endotel pembuluh darah yang berasal dari sel manusia yang lazim digunakan berasal dari vena umbilikal (Nurhidayat, 2010). Kultur sel endotel manusia (HUVECs) diperoleh dari vena umbilikus manusia. Umbilikus yang digunakan harus memenuhi kriteria inklusi, yaitu didapatkan dari hasil persalinan Sectio Caesaria (SC) yang meliputi kehamilan fisiologis (normal), kehamilan dengan pinggul sempit dan kehamilan dengan letak melintang. Sedangkan umbilikus hasil persalinan SC yang tidak boleh digunakan adalah kehamilan disertai infeksi, hipertensi atau kondisi ketuban pecah dini (Djati MS, 2010). Umbilikus yang didapat dari hasil persalinan disimpan dalam media transport (cord solution) dengan komposisi NaBic, M 199 dan gentamycin. Penyimpanan dalam medium ini bertujuan untuk mempertahankan kondisi fisiologi umbilikus sebelum dilakukan kultur. Umbilikus harus segera ditumbuhkan paling lama 12 jam setelah proses persalinan agar kondisi sel yang didapatkan setelah ditumbuhkan dapat optimal (Djati MS, 2010). Sel endotel digunakan dalam penelitian ini karena menurut Boulomie (1999), HUVECs mengekspresikan reseptor fungsional terhadap leptin yang merupakan produk dari ob gene. Sel endotel ditumbuhkan dalam medium komplit yang terdiri dari M 199 yang mengandung FBS 10 %. 2.2 Kegunaan Kegunaan kultur sel menurut Muhammad (2012) adalah : 1) Melestarikan sifat sel. 2) Menghasilkan sel yang memiliki sifat sama. 3) Menghasilkan sel baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang singkat. 4) Dapat menghasilkan sel yang bebas virus. 5) Dapat dijadikan sarana untuk melestarikan plasma nutfah. 6) Untuk menciptakan varietas baru melalui rekayasa genetika. Sel yang telah direkayasa dikembangkan melalui kultur jaringan sehingga menjadi sel baru secara lengkap. 7) Pelaksanaannya tidak tergantung pada musim. Beberapa kelebihan dan keuntungan penggunaan kultur sel meliputi : 1) Mudah dikontrol fisikokimia lingkungan (pH, suhu, tekanan oksigen, dan CO2) dapat dikontrol sesuai dengan keinginan. 2) Mudah dibuat homogen sehingga mudah dianalisis. 3) Ekonomis, tidak perlu memakai banyak hewan coba. 4) Mudah diadakan perlakuan. Kekurangan dan kerugian kultur sel antara lain : 1) Memerlukan keahlian, mempunyai peneliti yang sangat menyenangi kultur sel, selalu menjaga aseptis, tertip dan sabar 2) Gambaran histologis sudah tidak nampak. 3) Tidak atau sukar untuk mengedentifikasi sifat-sifat seperti pada in vivo, misalkan akibat pengaruh sistemik. (Noor, 2013) Kegunaan kultur sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) diantaranya adalah untuk mengetahui : 1) Aktivitas intraseluler sel endotel HUVECs 2) Interaksi lingkungan terhadap sel endotel HUVECs 3) Produk sel endotel HUVECs 4) Genetika sel endotel HUVECs 5) Transplantasi dan transfeksi sel endotel HUVECs Dalam penelitian ini menggunakan skrining bioassay umum adalah untuk informasi awal tentang potensi bahan farmakologi untuk selanjutnya sebagai prediksi indikasi terapetik dalam bidang kesehatan (Permatasari N, 2012). 2.3 Prinsip Kultur sel merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari sekelompok sel serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi sel baru yang lengkap kembali. Teori yang mendasari tehnik kultur sel adalah teori sel oleh Schawann dan Scheleiden (1838) yang menyatakan sifat totipotensi (total genetic potential) sel, yaitu bahwa setiap sel manusia yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi sel manusia yang utuh, jika kondisinya sesuai (Muhammad, 2012). Prinsip dalam pemeriksaan kultur sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) harus dilakukan dengan teknik steril.dan dalam kondisi aseptik. Sel HUVECs dapat hidup bebas apabila diberi kondisi tertentu sesuai dengan kebutuhan hidup sel. Sel dapat menunjukkan tanda-tanda hidup dan dapat mengekspresikan karakter sel sesuai dengan tingkat diferensiasinya. Sel ditumbuhkan di dalam media kultur. Media kultur berisi bahan-bahan untuk pertumbuhan sel seperti nutrien, growth factors, sumber ion, antibiotik, prekursor biosintesis, metabolit, stimulan dan vitamin. Di dalam media kultur, sel mampu berproliferasi membentuk selapis sel (mono layer) pada dasar/dinding tabung. 2.4 Metode Primary cell culture (Kultur sel primer), setelah mendapat sel yang sudah terpisah-pisah langsung ditanam di dalam cawan kultur. Cara menanam kultur sel primer, diantaranya : 1) Kerjalah dengan aseptik dan teliti. 2) Dipikirkan sel apa yang akan dikultur. 3) Sel dipisah-pisahkan dari jarinan – Enzimatik: tripsin, kolagenase – Mekanik: gojog-gojog dan vorteks bergantian 4) Disaring dengan saringan yang tidak perlu terlalu kecil. 5) Dihitung selnya sebelum ditanam, sel ada di dalam media tanpa zat penumbuh. Dengan memakai hemositometer. 6) Kalau hemositometernya mempunyai 2 bilik, untuk rata-rata dapat menghitung ulang di bilik satunya. Jika hanya satu bilik, cuci dulu dan hitung lagi dengan suspensi baru. (Noor, 2013) 2.5 Bahan Isolasi Sel Endotel Kolagenase (Sigma tipe IIA) dilarutkan pada serum free (medium 199, glutamine, peisilin streptomisin) yang sudah disentralisasi melalui filtrasi dengan prefilter 0,5 dan filter 0,2 µm. Konsentrasi akhir kolagenase yang dipergunakan sebesar 0,5 mg/ml (Permatasari N, 2012). Perbandingan pemakaian larutan kolagenase dan panjang umbilicus adalah 10-20 cm umbilicus tiap kolagen, HCl 0,1 N dan 5 N (Permatasari N, 2012). Gambar 2.2 Bahan Isolasi Sel Endotel 2.6 Media Kultur 2.6.1 Serum Free, yang mengandung : 1) Medium 199 (Gibco) 2) Penisilin (~ 100 µ/ml) 3) Streptomisin (~ 100 µ/ml) (Sigma) 4) Larutan natriumbicarbonat-phenol red (21 mM/ml) 5) Glutamine (2 mM/ml) 2.6.2 Media Kultur, yang mengandung : 1) Serum free medium 2) New Born calf Serum (NBS) (Permatasari N, 2012) 2.7 Alat (Instrumen) Untuk Kultur HUVECs 2.7.1 Laminar air flow biohazard type 2 (Esco Bre) (a) (b) Gambar 2.3a,b. Alat Laminar air flow biohazard type 2 (Esco Bre) 2.7.2 Timbangan magnetic Gambar 2.4 Timbangan magnetic 2.7.3 Lampu ultraviolet Gambar 2.5 Lampu ultraviolet 2.7.4 Sentrifuge Gambar 2.6 Sentrifuge 2.7.5 Incubator CO2 (a) (b) Gambar 2.7a,b. Incubator CO2 2.7.6 Mikroskop inverted (Nikon) Gambar 2.8 Mikroskop inverted (Nikon) 2.7.7 Tabung CO2 (eraus) Gambar 2.9 Tabung CO2 (eraus) 2.7.8 Mikropipet Gambar 2.10 Mikropipet 2.7.9 Flask kultur, luasnya 25 cm2 (a) (b) Gambar 2.11a,b Flask Kultur 2.7.10 TC Well Plate (Well plate 6) Gambar 2.12 TC Well Plate (Well plate 6) 2.7.11 Klem Tali Pusat dan Pinset Gambar 2.13 Klem Tali Pusat Dan Pinset 2.7.12 Kanul Gambar 2.14 Kanul 2.7.13 Cairan water dan PBSA Gambar 2.15 Cairan Water dan PBSA 2.7.14 Sarung tangan Gambar 2.16 Sarung Tangan 2.7.15 Aluminium foil Gambar 2.17 Aluminium Foil 2.7.16 Spuit 10 cc Gambar 2.18 Spuit 10 cc (Permatasari N, 2012) 2.8 Pengukuran Ca2+ Sitosol (Fura 2-AM) 2. 8.1 Bahan 1) Fura 2-AM (Sigma) yang dilarutkan dalam DMSO 2) Hepes Bufer 3) Fetal Bovine Serum (FBS) 2. 8.2 Alat 1) Mikroskop fluoresens Multicompound Nikon Optiphot2 2) Dilengkapi dengan kamera komputer dan image analyzer software. (Permatasari N, 2012) 2.9 Cara Pembuatan Larutan Pembuatan larutan untuk isolasi sel endotel menurut kriteria Jones (1996) adalah : 2.9.1 Pembuatan larutan HEPES 1) Di larutan 47,5 gram HEPES ke dalam 200 ml deionized water. 2) Disterilisasi secara filtrasi melalui filter 0,2 µ, simpan dalam -20 °C/6 bulan. 2.9.2 Pembuatan larutan bicarbonate phenol red 1) Dilarutkan 44 gram sodium hydrogen bicarbonate dan 30 mg phenol red ke dalam 1000 ml deionized water. 2) Diukur pH 7,6. 3) Sterilisasi ke dalam autoclave selama 10 menit pada suhu 115 °C. 4) Disimpan pada suhu 4 °C/6 bulan. 2.9.3 Pembuatan larutan gentamicin 1) Dilarutkan 75 mg gentamicin sulfat ke dalam 10 ml deionized water. 2) Sterilisasi dengan cara filtrasi melalui filter 0,2 µm 3) Disimpan pada suhu -20 °C/6 bulan. 2.9.4 Pembuatan medium cord solution 1) Diambil 8 ml HBSS dan ditambahkan 80 ml deionized water. 2) Dimasukkan 3,75 ml sodium hydrogen bicarbonate. 3) Ditambahkan 2,5 ml HEPES. 4) Ditambahkan 1,25 ml gentamycin. 5) Dilarutkan 200 µl dan 2 tetes HCl 10 N, pH 7,4 – 7,8. 6) Simpan dalam refrigerator suhu 4 °C. 2.9.5 Pembuatan larutan penisilin streptomisin 1) Dilarutkan 23,95 penisilin dan 52,50 mg streptomisin ke dalam 10 ml deionized water. 2) Sterilisasi dengan filtrasi 0,2 µm setiap 2,5 ml. 3) Disimpan pada suhu 20 °C/6 bulan. 2.9.6 Pembuatan larutan glutamine 1) Dilarutkan 0,292 g L-Glutamine dalam 10 ml deionized water. 2) Sterilisasi dengan filtrasi melalui prefilter 0,5 µm, kemudian filter 0,2 µm. 3) Disimpan pada suhu 20 °C/6 bulan. 2.9.7 Pembuatan medium serum free 1) Disediakan M 199 100 ml dalam kondisi tertutup aluminium foil, kemudian masukkan 1,25 ml penisilin streptomisin. 2) Diukur pH 7,2. 3) Ditambahkan 5 ml larutan bicarbonate phenol red dan 1,25 ml glutamine. 4) Sterilisasi dengan filtrasi 0,2 µm. 5) Disimpan pada suhu 4 °C. 2.9.8 Pembuatan medium kultur 1) Diambil 20 ml serum free pH 7,2 100 ml dalam kondisi tertutup aluminium foil, kemudian tambahkan 2,5 ml Fetal Bovine Serum (FBS). 2) Dimasukkan 2,5 ml NBS. 3) Diukur pH 7,1. 4) Sterilisasi dengan filtrasi 0,2 µm. 5) Disimpan pada suhu 4 °C. 2.9.9 Pembuatan larutan collagenase 1) Dilarutkan 0,005 g collagenase dalam 8 ml serum free. 2) Ukur pH 7,20. 3) Ditambahkan 50 µl HCl 1 N dan satu tetes HCl. 4) Sterilisasi dengan filtrasi melalui filter 0,2 µm. 5) Disimpan pada suhu 4 °C. (Permatasari N, 2012) 2.10 Prosedur Kerja Isolasi Dan Pembuatan Kultur HUVECs 2.10.1 Umbilicus dibersihkan dari jaringan dan bekuan darah yang ada dengan kertas tisu yang disemprot dengan alkohol 70%. 2.10.2 Masing-masing ujung umbilicus dipotong transversal sehingga terlihat dua arteri dan satu vena. 2.10.3 Vena akan terlihat mempunyai dinding yang lebih tebal, lebih besar dan elastis. Dicari vena yang paling besar dengan menggunakan pinset. Gambar 2.19 Langkah Ke-3 2.10.4 Kanul dimasukkan pada salah satu ujung vena (± 1,5 cm) kemudian di klem dengan catatan kanul tidak boleh lepas tapi tidak boleh buntu. Gambar 2.20 Langkah Ke-4 2.10.5 Vena dibersihkan/dibilas dengan 10 ml water 1 kali kemudian dibilas lagi dengan larutan PBSA 10 ml melalui kanul yang telah terpasang dengan spuit 10 cc sampai darahnya hilang dan bersih (bilasan dengan PBSA bisa dilakukan berkali-kali sampai darah benar-benar bersih). Gambar 2.21 Langkah Ke-5 2.10.6 Setelah bersih, ujung umbilicus yang lain di klem. Gambar 2.22 Langkah Ke-6 2.10.7 Masukkan larutan collagenase 5 ml seperti cara diatas dan spuit dibiarkan tetap menancap pada kanul. Enzim collagenase dipergunakan untuk merontokkan sel endotel. Gambar 2.23 Langkah Ke-7 2.10.8 Umbilicus yang mengandung larutan collagenase dihangatkan dengan cara didekap dengan kedua belah tangan dan didekatkan dengan api yang menyala di ruang laminar (agar mencapai suhu ~ 37 °C) selama 5-10 menit. Dalam penelitian ini menggunakan waktu 7 menit. 2.10.9 Collagenase yang telah mengandung endotel dikeluarkan dari umbilicus dengan cara menyedot melalui spuit yang masih terpasang pada ujung kanul. 2.10.10 Larutan collagenase dimasukkan pada tabung sentrifuge steril 15 cc. Gambar 2.24 Langkah Ke-10 2.10.11 Umbilicus dibilas dengan 8 ml larutan PBSA seperti diatas untuk membilas sel endotel yang masih tersisa kemudian disedot kembali seperti cara diatas dan ditambahkan ke tabung sentrifuge yang berisi larutan collagenase. Gambar 2.25 Langkah Ke-11 2.10.12 Larutan yang telah mengandung sel endotel tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Gambar 2.26 Langkah Ke-12 2.10.13 Supernatan dibuang kemudian ditambahkan 4 ml medium kultur (medium kerja M 199) pada pellet dan diresuspensi dengan pipetting sehingga sel endotel terpisah. Medium Kerja (M 199) ditambahkan SF yang mengandung tripsin EDTA. Gambar 2.27 Langkah Ke-13 2.10.14 Larutan dipindahkan ke dalam TC well plate (six well plate) yang sebelumnya dilapisi gelatin 0,2%. Gambar 2.28 Langkah Ke-14 2.10.15 Dimasukkan pada incubator CO2 5% pada suhu 37 °C selama 30 menit atau sampel sel lepas (sel confluence : sel penuh dan tumbuh). Gambar 2.29 Langkah Ke-15 2.10.16 Enam sumuran (six well plate) diambil dan sel endotel diamati dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 400 kali. Gambar 2.30 Langkah Ke-16 2.10.17 Jika sel sudah menempel pada dasar sumuran, medium kultur diambil dan sel dibilas dengan larutan serum free 3 ml melalui filter 0,2 µm. Serum free diambil dengan spuit steril dan digantikan dengan medium kultur 4 ml melalui filter 0,2 µm. 2.10.18 Enam sumuran dimasukkan dalam incubator sampai monolayer (membentuk coblastone) ± 3-4 hari. 2.10.19 Medium diganti tiap 2 hari sekali. (Permatasari N, 2012) 2.11 Hasil Dan Diskusi Pemeriksaan Kultur Di Sel Endotel Vena Umbilicus Manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Secara umum, proses pelaksanaan langkah-langkah kultur sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) sudah diterapkan dengan benar dibawah bimbingan laboran dari Laboratorium Biomedik, dan semua peserta mengikuti dengan antusias prosesnya mulai dari awal, namun karena memang keterbatasan alat, bahan dan media kultur tidak semua mahasiswa mencoba dari awal sampai akhir, dan dilakukan prosesnya secara bergantian pada tiap-tiap proses. Kembali lagi pada tujuan pembelajaran praktikum ini, maka hal tersebut kami lakukan agar proses pembelajaran berjalan sesuai, dan yang terpenting mahasiswa mengetahui mana teknik yang benar, dan mana teknik yang salah, serta memahami solusi pemecahan masalahnya. Dalam praktikum kultur sel endotel manusia (HUVECs) diperoleh dari vena umbilikus manusia. Umbilikus yang digunakan telah memenuhi kriteria inklusi, yaitu didapatkan dari hasil persalinan Sectio Caesaria (SC) yang meliputi kehamilan fisiologis (normal), kehamilan dengan pinggul sempit dan kehamilan dengan letak melintang. Sedangkan kriteria eksklusi dalam penelitian ini adalah umbilikus hasil persalinan SC dengan kehamilan disertai infeksi, hipertensi atau kondisi ketuban pecah dini. Umbilikus yang telah memenuhi kriteria inklusi diatas kemudian disimpan dalam media transport (cord solution) dengan komposisi NaBic, M 199 dan gentamycin. Penyimpanan dalam medium ini bertujuan untuk mempertahankan kondisi fisiologi umbilikus sebelum dilakukan kultur. Umbilikus segera ditumbuhkan secara in vitro setelah proses persalinan dalam waktu 12 jam agar kondisi sel yang didapatkan setelah ditumbuhkan dapat optimal. Prinsip dalam pemeriksaan kultur sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) dalam praktikum ini dilakukan dengan teknik steri dan dalam kondisi aseptik serta ditumbuhkan dalam media yang memungkinkan sel HUVECs untuk hidup (disesuaikan dengan kebutuhan hidup sel) yang berisi bahan-bahan untuk pertumbuhan sel seperti nutrien, growth factors, sumber ion, antibiotik, prekursor biosintesis, metabolit, stimulan dan vitamin. Di dalam media kultur, sel mampu berproliferasi membentuk selapis sel (mono layer) pada dasar/dinding tabung. Metode yang digunakan dalam penelitian ini merupakan primary cell culture yangmana sel dipisahkan dari jaringan secara enzimatik menggunakan kolagenase. Hasil pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) melalui pengamatan dengan menggunakan mikroskop inverted dengan perbesaran 400 kali yang dilengkapi dengan kamera komputer image analyzer software ditunjukkan pada gambar di bawah ini : (a) (b) (c) (d) Gambar 2.30a,b,c,d Hasil Pemeriksaan Kultur Sel Endotel HUVECs  Diskusi : Menurut Arjita, dkk (2002), ciri-ciri sel endotel normal secara morfologis adalah bentuk sel endotel cobblestone dengan ciri spesifik sel pada bagian tengah tampak bulat dan terang (menyala), bentuk sel pipih dengan jarak antara sel yang teratur dan rapat, permukaan sel mulus ditandai dengan penampakan inti, membran plasma, sitoplasma, extra celluler matriks (ECM) dan tidak terdapat sel yang apoptosis serta monolayer primer. Evaluasi kultur sel diantaranya menurut Noor (2013) : 1) Jika sel hidup, media jernih dan warna media agak menguning 2) Jika sel mati, media makin jambu dan agak keruh 3) Dengan melihat dibawah mikroskop inversi, kelihatan sel melekat di dasar cawan 4) Jika sel mengapung di media setelah 24 jam, berarti sel mati Dari hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop inverted dengan perbesaran 400 kali yang dilengkapi dengan kamera komputer image analyzer software, terdapat sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) dengan ciri-ciri bentuk sel endotel cobblestone dengan ciri spesifik sel pada bagian tengah tampak bulat dan terang (menyala), bentuk sel pipih dengan jarak antara sel yang teratur dan rapat, permukaan sel mulus ditandai dengan penampakan inti, membran plasma, sitoplasma, extra celluler matriks (ECM) dan tidak terdapat sel yang apoptosis serta monolayer primer yang tumbuh confluent (Sel confluent dicirikan dengan populasi sel yang memenuhi tempat attachment dan saling bersentuhan antar sel menandakan adanya hubungan komunikasi agar sel tumbuh) pada media yang jernih dan warna media agak menguning dan menempel/melekat pada dasar media flask kultur, terdapat bagian sel yang akan tumbuh menjadi sel endotel baru, selain itu disekitarnya masih terdapat sisa-sisa sel eritrosit yang kemungkinan disebabkan karena pencucian menggunakan PBSA yang belum bersih. Jika menanam sel yang masih tercampur dengan eritrosit, pisahkan eritrosit dari sel-sel yang diinginkan dengan menambahkan EDTA. Ditunggu sebentar baru sel terpisah dari eritrosit. Dalam keadaan ini, sel dalam keadaan hidup dan siap diperlakukan untuk keperluan penelitian. Akan tetapi pada praktikum ini masih sebatas sampai flask kultur, belum sampai pada tahap subkultur dikarenakan keterbatasan waktu.   BAB III PENUTUP 3.1 Kesimpulan Dari hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop inverted dengan perbesaran 400 kali yang dilengkapi dengan kamera komputer image analyzer software, terdapat sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) dengan ciri-ciri bentuk sel endotel cobblestone dengan ciri spesifik sel pada bagian tengah tampak bulat dan terang (menyala), bentuk sel pipih dengan jarak antara sel yang teratur dan rapat, permukaan sel mulus ditandai dengan penampakan inti, membran plasma, sitoplasma, extra celluler matriks (ECM) dan tidak terdapat sel yang apoptosis serta monolayer primer yang tumbuh confluent pada media yang jernih dan warna media agak menguning dan menempel/melekat pada dasar media flask kultur, terdapat bagian sel yang akan tumbuh menjadi sel endotel baru, selain itu disekitarnya masih terdapat sisa-sisa sel eritrosit yang kemungkinan disebabkan karena pencucian menggunakan PBSA yang belum bersih. Jika menanam sel yang masih tercampur dengan eritrosit, pisahkan eritrosit dari sel-sel yang diinginkan dengan menambahkan EDTA. Ditunggu sebentar baru sel terpisah dari eritrosit. Dalam keadaan ini, sel dalam keadaan hidup dan siap diperlakukan untuk keperluan penelitian. Akan tetapi pada praktikum ini masih sebatas sampai flask kultur, belum sampai pada tahap subkultur dikarenakan keterbatasan waktu. 3.2 Saran Diharapkan pemeriksaan kultur di sel endotel vena umbilicus manusia/Human Umbillical Vein Endothelial Cells (HUVECs) dapat meningkatkan kompetensi profesi kebidanan dalam bidang biologi molekuler yang bisa bermanfaat terhadap pemberian pelayanan kebidanan kepada ibu, bayi, keluarga dan masyarakat sehingga dapat meningkatkan kesehatan bagi ibu, bayi, keluarga maupun masyarakat.